فعالیت پروتئولیز شرط بندی ترکیبات کیمریک (POTAC) در سرطان پستان منفی سه گانه

سرطان منفی سه گانه (TNBC) یک بیماری غیرقابل تحمل است که در آن راهکارهای درمانی جدید مورد نیاز است. پروتئولیز هدفمند کیمریک (POTAC) ترکیبات جدیدی هستند که با اتصال به یک لیگاز ubiquitin ، تخریب پروتئین را تقویت می کنند. در این کار ، ما به بررسی فعالیت ضد توموری دو پروتئین جدید BET ، MZ1 و ARV-825 ، در TNBC ، سرطان تخمدان و در یک مدل مقاوم در برابر مهار کننده BET پرداختیم.

مواد و روش ها

رده های سلولی OVCAR3 ، SKOV3 ، BT549 ، MDA-MB-231 و رده سلولی مقاوم به JQ1 MDA-MB-231R مورد بررسی قرار گرفت. MTTS ، سنجش تشکیل کلونی ، کشتهای سه بعدی در ماتریژل ، فلوسیتومتری جریان و لکه های وسترن برای کشف اثر ضد پرولیفراتیو و مکانیسم بیوشیمیایی عملکرد MZ1 و ARV-825 انجام شد. در مطالعات داخل بدن شامل موش های BALB/C Nu/Nu با سلول های MDA-MB-231R پیوند خورده است.

نتایج

BET-PROTACS MZ1 و ARV-825 به طور موثر سطح بیان پروتئین پروتئین BET BRD4 ، در MDA-MB-231 و MDA-MB-231R را تنظیم کردند. MZ1 و ARV-825 همچنین اثر ضد پرولیفراتیو بر سلولهای حساس و مقاوم نشان دادند. این اثر در سایر رده های سلولی منفی سه گانه منفی (BT549) و سرطان تخمدان (SKOV3 ، OVCAR3) تأیید شد. MZ1 دستگیری G2/M را در MDA-MB-231 تحریک کرد. علاوه بر این ، یک اثر عمیق بر آپوپتوز وابسته به کاسپاز در هر دو سلول حساس و مقاوم مشاهده شد. هیچ فعالیت هم افزایی هنگامی که با Docetaxel ، Cisplatin یا Olaparib ترکیب شد ، مشاهده نشد. سرانجام ، در داخل بدن تجویز MZ1 رشد تومور را در یک مدل زنوگرافت مقاوم به JQ1 نجات داد و سطح بیان BRD4 را کاهش داد.

نتیجه گیری

با استفاده از هر دو روش آزمایشگاهی و in vivo ، ما فعالیت عمیق پروتئین های BET را در مدلهای TNBC والدین و مقاوم به Beti توصیف می کنیم. این داده ها گزینه هایی را برای توسعه بالینی بیشتر این عوامل در TNBC فراهم می کند.

زمینه

سرطان پستان منفی سه گانه (TNBC) یک تومور بسیار تهاجمی است که در حال حاضر هیچ روش درمانی درمانی در حال حاضر وجود ندارد [1]. این حدود 15 ٪ از کل تومورهای پستان را تشکیل می دهد ، و با پیش آگهی ضعیف ، به ویژه برای بیماران مبتلا به بیماری پیشرفته و درجه بالایی از عود برای افراد تشخیص داده شده در مراحل اولیه همراه است [1 ، 2]. در این زمینه ، شناسایی آسیب پذیری های انکوژنیک که از نظر دارویی مهار می شوند ، یک هدف اصلی است.

مواد و روش ها

رده های سلولی TNBC و تخمدان ، MDA-MB-231 و BT549 و SKOV3 ، به ترتیب ، در DMEM کشت داده شدند ، و سلولهای تخمدان OVCAR3 در RPMI همراه با سرم بووی جنین (10 ٪) ، آنتی بیوتیک ها (100 U/ML Penicillin و Penicillin و Penicillin و Penicillin و Penicillin و ML و آنتی بیوتیک ها کشت داده شدند. 100 /میلی لیتر استرپتومایسین) و L- گلوتامین (2 میلی متر) (گیبکو (ترموفیشر) ، سیگما-آلدریچ) (37 درجه سانتیگراد ، 5 ٪ CO

). تمام خطوط سلولی مورد استفاده توسط DRS تهیه شده است. J. Losada و A. Balmain ، که آنها را از ATCC خریداری کردند ، در سال 2015. صحت سلول ها با تجزیه و تحلیل STR در واحد زیست شناسی مولکولی در بیمارستان دانشگاه سالامانکا تأیید شد. رده سلولی مقاوم در برابر MDA-MB-231 (MDA-MB-231R) با قرار گرفتن در معرض پالس در برابر افزایش دوزهای JQ1 (72 ساعت پالس هر 2 هفته به مدت 6 ماه) بدست آمد.

مهار کننده های BET (JQ1 (HPLC: 99. 6 ٪ خلوص) و OTX-015 (HPLC: 99. 82 ٪ خلوص) و Protacs-BRD4 (HPLC: 99. 5 ٪ خلوص) و ARV-825 (LCMS: 99. 37 ٪ خلوص))) همراه باشکل غیرفعال MZ1 ، CIS-MZ1 (HPLC: 98. 6 ٪ خلوص) ، از Selleckchem (هوستون ، TX) و Tocris Bioscience (سیستم های R& D Bio-Techne ، S. LU) خریداری شد.

MTT ، تشکیل مستعمره و تهاجم سه بعدی

برای سنجش رنگ سنجی MTT ، پس از درمان ، محیط سلولی با محلول MTT (DMEM بدون فنل قرمز با MTT 0. 5 میکروگرم بر میکرولیتر) (45 دقیقه ، 37 درجه سانتیگراد) جایگزین شد. سپس از DMSO برای حل نمونه ها استفاده شد. مقادیر جذب در یک خواننده صفحه چندگانه (555 نانومتر با طول موج مرجع 690 نانومتر) ثبت شد. برای مطالعات هم افزایی ، ما از الگوریتم Chou-Talalay استفاده کردیم ، که اجازه می دهد شاخص ترکیبی (CI) را بدست آوریم تا مشخص شود کدام ترکیبات هم افزایی هستند (CI₂1) با استفاده از نرم افزار Calcusyn 2. 0.

برای سنجش کلونوژنیک ، سلولهای تحت درمان با 24 ساعته برای هر شرایط در سه قطعه شمارش و بذر قرار گرفتند. پس از 10 روز ، سلول ها با گلوتارآلدئید (0. 5 ٪ ، 15 دقیقه) ثابت شدند و سپس با بنفش کریستال (0. 05 ٪ ، 15 دقیقه) رنگ آمیزی شدند. مستعمرات با استفاده از نرم افزار Image J اندازه گیری شدند. برای سنجش تهاجم سه بعدی ، سلولها بر روی صفحات 48 چاه حاوی یک لایه 1 میلی متر ماتریگل (سیگما-آلدریچ) کاشته شدند و به مدت 72 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. ماتریگل یک شبکه تولید می کند که از ماتریس خارج سلولی تقلید می کند. ساختارهای سه بعدی مهاجم با استفاده از میکروسکوپ معکوس مورد بررسی قرار گرفت و قطر آنها با استفاده از نرم افزار Image J اندازه گیری شد.

آزمایش های فلوسیتومتری

برای تجزیه و تحلیل چرخه سلولی ، پس از 12 ساعت از درمان ، سلول ها در 70 ٪ اتانول در PBS (15 دقیقه) ثابت شدند. گلوله های سلولی در PBS + 2 ٪ BSA شسته شدند و با محلول رنگ آمیزی پروپیدیوم یدید/RNase (1 ساعت ، 4 درجه سانتیگراد ، در تاریکی ؛ Immunostep) انکوبه شدند.<1), additive (CI = 1), or antagonic (CI>برای مطالعات مرگ و میر سلولی ، پس از 48 یا 96 ساعت از درمان ، سلولهای چسبنده و شناور جمع آوری و پس از شستشو با PBS ، با بافر اتصال دهنده ضمیمه حاوی ضمیمه V-DT-634 و یدید پروپیدیوم (2 میلی گرم در میلی لیتر) رنگ آمیزی شدند (1)H ، rt ، در تاریکی ؛ Immunostep). برای سنجش کاسپاز ، سلولها با مهار کننده Pan-caspase QVD (10 میکرومولار ، 45 دقیقه ؛ سیگما آلدریچ) از قبل تحت درمان قرار گرفتند.

تمام تجزیه و تحلیل ها با استفاده از نرم افزار FACS Diva بر روی یک فلوسیتومتر جریان FACSCANTO ™ II انجام شد.

تجزیه و تحلیل بیان پروتئین: وسترن بلات

برای ارزیابی سطح پروتئین ، سلولهای MDA-MB-231 و MDA-MB-231R (ظرف 500. 000 سلول/100 میلی متر) و روز بعد ، به صورت متوالی تحت درمان قرار گرفتند: اول ، نقاط 48 ساعت. روز بعد ، امتیاز 24 ساعته ؛و سرانجام ، امتیاز 12 ساعت. تمام درمان ها به طور موازی 72 ساعت پس از بذر به همراه کنترل غیر درمان نشده آنها جمع آوری شد.

برای ارزیابی چرخه سلولی و پروتئین های مرتبط با آپوپتوز ، سلولها به ترتیب 12 ساعت و 96 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. سپس سلول ها لیز شدند و عصاره پروتئین (25-60 میکروگرم) برای تجزیه و تحلیل وسترن بلات با آنتی بادی های نشان داده شده (پرونده اضافی 2) استفاده شد.

فعالیت کاسپاز 3

بافر واکنش کاسپاز به عصاره پروتئین (50 میکروگرم ، 1 ساعت ، 37 درجه سانتیگراد ، در تاریکی) اضافه شد. سپس فلورسانس (400/50 نانومتر) اندازه گیری شد.

در مطالعات داخل بدن

موش های BALB/C Nu/Nu (4-5 هفته ، تعداد = 13) لنت های چربی پستاندار با MDA-MB-231R (10 × 2. 5) تزریق شدند. درمان روزانه با JQ1 (25 میلی گرم در کیلوگرم ، به عنوان مثال) هنگامی که تومورها به حجم 80-150 میلی متر 3 رسیدند ، آغاز شد. پس از 1 هفته درمان با JQ1 ، گروهی از حیوانات (6 نفر) تحت این رژیم مرکب ادامه یافتند ، در حالی که گروه دیگری (7 نفر) درمان MZ1 (10 میلی گرم در کیلوگرم ، I. P.) را دریافت کردند. رشد تومور برای دو هفته دیگر مورد بررسی قرار گرفت. سپس تومورها در دمای 80 درجه سانتیگراد جمع آوری ، وزنی و ذخیره شدند. برای تجزیه و تحلیل وسترن بلات ، نمونه های تومور (N = 5 = N = 7 ؛ N = 7 تحت درمان با MZ1) با یک Dispomix Sonicator در بافر لیز سرد (1. 5 میلی لیتر در 100 میلی گرم نمونه) همگن شدند. برای ارزیابی سطح پروتئین ، 60 میکروگرم پروتئین استفاده شد.

تحلیل آماری

ما از آزمون t برای نمونه های مستقل استفاده غیر پارامتری ، همراه با آزمون Levenne استفاده کردیم تا واریانس مساوی یا سنجش ANOVA را با زیرگروه توکی در نظر بگیریم ، یا خیر. سطح اهمیت 95 ٪ در نظر گرفته شد (* 05/0 ≤ P ؛ ** P ≤ 0. 01 و *** P ≤ 0. 001). PRISM نرم افزاری و SPS از SPS استفاده شد.

نتایج

Protacs سطح BRD4 را در رده های سلولی مقاوم در برابر BETI کاهش می دهد

اول ، ما مهار کننده BET-PROTAC MZ1 را بر اساس ساختار شیمیایی JQ1 [14] ، بر روی سلولهای MDA-MB-231 والدین و بر روی یک مدل منحصر به فرد از سلولهای TNBC مقاوم به JQ1 که از فوق الذکر است ، ارزیابی کردیم. مهار عمیق از BRD4 و BRD2 در هر دو مدل سلولی پس از درمان MZ1 مشاهده شد ، با وجود این که سطح بیان پایه Brd4 در مدل مقاوم بسیار بالاتر بود (شکل 1A). به طور مشابه ، کاهش سطح پروتئین های BET پس از درمان ARV-825 مشاهده شد ، یک پروتئین که از OTX-015 ، BETI دیگر به عنوان ستون فقرات استفاده می کند [15]. با این حال ، این اثر به ویژه در BRD4 در مدل مقاوم خفیف تر بود ، چه چیزی می تواند به دلیل این سطح بالا از این پروتئین نشان داده شده توسط این سلول ها باشد (شکل 1A).

ارزیابی اثربخشی BRD4-ProTACS (MZ1 و ARV-825) در مقایسه با مهار کننده های BET (JQ1 و OTX-015) در سلول های مقاوم در برابر JQ1 MDA-MB-231 و MDA-MB-231 (MDA-MB-231R)وادآ . MDA-MB-231 و MDA-MB-231R با JQ1 ، MZ1 و ARV-825 به مدت 12 ، 24 یا 48 ساعت (0. 4 میکرومتر) تحت درمان قرار گرفتند. سپس سلولها لیز شدند و 25 میکروگرم عصاره پروتئین کل توسط وسترن بلات با آنتی بادی های ضد BRD4 و ضد BRD2 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. از کالنکسین به عنوان کنترل بار استفاده شد. مدل های b. parental و مقاوم به دست آمده با JQ1 ، MZ1 ، OTX-015 و ARV-825 (0. 2،0. 4 و 1 میکرومتر) درمان شدند. استریوایزومر غیرفعال CIS-MZ1 به عنوان کنترل منفی استفاده شد. زنده ماندن سلول با متابولیسم MTT پس از 48 یا 96 ساعت مورد بررسی قرار گرفت. ج. MDA-MB-231 و MDA-MB231R روز قبل از آغاز درمان ها در یک ماتریس ماتریژل نیمه جامد کاشته شدند. سپس ، ظرفیت تهاجم ماتریگل به دنبال یک درمان 72 ساعته با JQ1 ، MZ1 و ARV-825 (0. 4 میکرومتر) مورد بررسی قرار گرفت و ساختارهای سه بعدی حمله شد. نمرات قطر به عنوان واحدهای دلخواه نشان داده شده است. نوار مقیاس = 100 میکرومتر. د. توانایی تشکیل کلونی پس از 12 ساعت قرار گرفتن در معرض JQ1 ، MZ1 یا ARV-825 (0. 4 میکرومتر). پس از درمان ، سلول ها با چگالی کم (500 سلول در چاه) و 10 روز بعد ، ثابت ، رنگ آمیزی با بنفش کریستال و شمارش شدند.* پ

نتایج

در مرحله بعد ، ما اثر ضد پرولیفراتیو مهار کننده های BET-ProTAC MZ1 و ARV-825 را در مقایسه با همتایان خود JQ1 و OTX015 ، در MDA-MB-231 و MDA-MB-231R بررسی کردیم. هر دو پروتئین BET باعث ایجاد یک فعالیت ضد پرولیفراتیو واضح در نقاط زمانی مختلف برای هر دو مدل سلولی می شوند ، که این اثر در مقاوم حتی بیشتر است (شکل 1B). تأثیر MZ1 و ARV-825 بیشتر در تهاجم ماتریژل (شکل 1C) و سنجش کلونوژنیک (شکل 1D) تأیید شد ، که نشان دهنده اثربخشی مشابه در هر دو رده سلولی است.

با توجه به فعالیت MZ1 و ARV-825 در MDA-MB-231 ساده لوح ، ما تصمیم گرفتیم که تأثیر آنها را بر روی سایر رده های سلولی TNBC نماینده و میزان این ارزیابی به سرطان تخمدان بررسی کنیم ، با توجه به ویژگی های مولکولی که بین هر دو نوع تومور مشترک است. یک فعالیت ضد پرولیفراتیو مربوط به MZ1 و ARV-825 در مقایسه با JQ1 و OTX-015 در رده سلولی TNBC BT549 و در دو رده سلولی تخمدان ، SKOV3 و OVCAR3 مشاهده شد (پرونده اضافی 1: شکل. S1 A ، B).

تأثیر پروتئین ها بر چرخه سلولی در سلولهای حساس و مقاوم JQ1<0.05; ** p <0.01; *** p <0.001

با توجه به اینكه ترکیبات BET-ProTAC ها اثر ضد پرولیفراتیو مربوط به رده های سلولی TNBC و تخمدان را نشان می دهند ، و این عوامل قادر به غلبه بر مقاومت در برابر BETI بودند ، ما تصمیم گرفتیم كه مکانیسم مولكولی فعالیت آنها را در هر دو رده های سلولی ساده لوح و مقاوم بررسی كنیم. وادبرای ارزیابی تأثیر آنها بر چرخه سلولی ، سلول ها برای اولین بار در معرض JQ1 قرار گرفتند. این BETI قادر به بازداشت سلولی در G1 در رده سلولی حساس بود ، در حالی که نتوانست این ایست بازرسی را در مقاوم فعال کند (شکل 2A). در مقابل ، MZ1 و ARV-825 G2/M را در مدل حساس افزایش داده و با همتای مقاوم آن مقایسه می شوند (شکل 2A). ارزیابی بیوشیمیایی اجزای چرخه سلولی نشان داد که در حالی که پروتئین ها به وضوح بیان P21 در سلولهای ساده را تقویت می کنند ، این افزایش در سلولهای مقاوم بسیار اندک بود (شکل 2B). همچنین ، در حالی که JQ1 باعث افزایش سطح CDC25C در MDA-MB-231 ساده ، MZ1 و ARV-825 می شود و باعث ایجاد تغییرات قابل توجهی در این سیکلین نمی شود. برعکس ، پروتئین ها سطح خود را در سلولهای مقاوم کاهش می دهند ، که در واقع سطح پایه ای بالاتری از CDC25C را نشان می دهد ، آنچه با حضور بیشتر سلولهای مقاوم در G1 ارتباط دارد. همانطور که انتظار می رود ، JQ1 به شدت این سیکلین را در مدل مقاوم تأثیر نمی گذارد (شکل 2B). در سطح جهان ، این داده ها نشان می دهد که پروتئین ها عمدتاً بر روی سلولهای بازداشت میتوز اولیه در مرحله G2 عمل می کنند.

چرخه سلولی و تجزیه و تحلیل مرگ سلولی در مدلهای MDA-MB-231 ساده و مقاوم در برابر BETI. آ . سلولهای MDA-MB-231 و MDA-MB-231R با JQ1 ، MZ1 و ARV-825 (0. 4 میکرومولار) به مدت 12 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. سپس ، چرخه سلولی توسط فلوسیتومتری جریان مورد بررسی قرار گرفت. نمودارهای نوار درصد سلولها را در مراحل چرخه سلولی G0/G1 ، S یا G2/M نشان می دهد. ب. MDA-MB-231 و MDA-MB-231R به مدت 12 ساعت با JQ1 ، MZ1 و ARV-825 تحت درمان قرار گرفتند. سپس سلولها لیز شدند و 50 میکروگرم عصاره پروتئین توسط وسترن-بلوط با آنتی بادی ها در برابر پروتئین های درگیر در پیشرفت چرخه سلولی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. از کالنکسین به عنوان کنترل بار استفاده شد. ج. مرگ سلولی تولید شده توسط JQ1 ، MZ1 و ARV-825 (0. 4 میکرومولار) در هر دو رده سلولی با استفاده از فلوسیتومتری جریان با PI و رنگ آمیزی آنکسین V (AV) مورد بررسی قرار گرفت. سلولها در سلولهای زنده (AV -، PI -) ، آپوپتوز اولیه (AV +، PI -) ، اواخر آپوپتوز (AV +، PI +) و سلولهای نکروتیک (AV -، PI +) طبقه بندی شدند. د. MDA-MB-231 ساده لوح و مقاوم در برابر JQ1 با مهار کننده Pan-caspase QVD (10 میکرومولار) به مدت 45 دقیقه قبل از قرار گرفتن در معرض داروها به مدت 48 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. مرگ سلولی با استفاده از فلوسیتومتری جریان همانطور که در C. e شرح داده شد ، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. فعالیت کاسپاز 3 با استفاده از فلورسانس (400/50 نانومتر) اندازه گیری شد و داده ها به کنترل اشاره شد.* پ

MZ1 و ARV-825 آپوپتوز را در سلولهای مقاوم به JQ1 القا می کنند

ما سپس تأثیر پروتئین ها بر مرگ سلولی را در هر دو سلول حساس و مقاوم بررسی کردیم. هر دو MZ1 و ARV-825 قادر به افزایش چشمگیر آپوپتوز در نقاط زمانی مختلف بودند که در مدل حساس کمی بالاتر بود (شکل 2C). تجویز یک مهار کننده پان کاسپاز در هر دو مدل به آپوپتوز بازگشت ، نشان می دهد که این مکانیسم عمدتاً وابسته به کاسپاز بود (شکل 2D). در حقیقت ، دو ترکیب پروتئین کاسپاز 3 را در هر دو رده سلولی فعال می کنند ، که این اثر در ساده لوح (شکل 2E و F) واضح تر است (شکل 2E و F) ، همانطور که در مطالعات فلوسیتومتری نیز مشاهده شد. این داده ها از تأثیر مشاهده شده پس از تجویز مهار کننده کاسپاز در این مدل پشتیبانی می کنند. ارزیابی بیوشیمیایی مکانیسم عمل نشان داد که سطح پروتئین ضد پپتوز MCL1 نیز در هر دو خط سلول کاهش می یابد. علاوه بر این ، پروتئین ها قادر به ایجاد آسیب DNA با فعال سازی H2AX و شکاف PARP در هر دو رده سلولی حساس و مقاوم بودند (شکل 2F).

تأثیر MZ1 در ترکیب با روشهای درمانی استاندارد

آ . ب. ج.*پ<0.05; ** p <0.01; *** p <0.001. f . Cells were treated with JQ1, MZ1, and ARV-825 for 96 h (0.4 μM). Cells were then lysed and 50 μg of protein extract were analyzed by Weste-blot with antibodies against proteins involved in apoptotic cell death. Calnexin was used as loading control

برای کشف اثربخشی MZ1 در تومورهای مقاوم به JQ1 در داخل بدن ، از مدل های Xenograft MDA-MB-231R استفاده شد. در ابتدا همه حیوانات برای اطمینان از مقاومت تومور با JQ1 تحت درمان قرار گرفتند و سپس به دو گروه تصادفی شدند. در حالی که تومورهای حیواناتی که درمان JQ1 را دنبال می کردند ، در حال رشد بودند ، MZ1 از پیشرفت تومور در گروه دیگر جلوگیری کرد (شکل 3C). ارزیابی سطح BRD4 در لیزات تومورها نشان داد که میانگین بیان این پروتئین BET در موش های تحت درمان با MZ1 در مقایسه با موش های تحت درمان با JQ1 ، تأیید تأثیر این پروتئین BET در داخل بدن است. هیچ اثری برای BRD2 مشاهده نشد (شکل 3D).

بحث

در مقاله حاضر ، ما فعالیت ضد تومور و مکانیسم عملکرد BET-ProTACS MZ1 و ARV-25 را در رده های سلولی TNBC و سرطان تخمدان و در یک رده سلولی TNBC مقاوم به JQ1 (MDA-MB-231R) شرح می دهیم. در حال حاضر ، اطلاعات مربوط به مکانیسم عمل این خانواده ترکیبات در رابطه با BETI محدود به لنفوم و لوسمی میلوئید حاد است [16] ، و تنها داده های محدود در تومورهای جامد یا در مدل های مقاوم به BETI وجود دارد. توسعه مقاومتها یک مشکل مرتبط برای کلیه روشهای درمانی پس از یک درمان طولانی مدت است و شناسایی عوامل که می توانند بر روی آن جمعیت نسوز عمل کنند ، یک هدف اصلی با ترجمه روشن به محیط بالینی است.

در مطالعه ما یک فعالیت ضد توموری قابل توجهی از پروتئین های BET در TNBC و سرطان تخمدان مشاهده کردیم ، که در مقایسه با BETI که در حال حاضر در حال رشد بالینی هستند ، بیشتر بود. این اثر با استفاده از رویکردهای مختلف ، از جمله تکثیر ، تهاجم و سنجش کلونوژنیک مشاهده می شود. این داده ها مطابق با مطالعات قبلی در AML است و لنفوم این ترکیبات مرگ و میر قدرتمند را نشان می دهند [16 ، 18].

پروتئین های BET قادر به کاهش کارآمد BRD4 و BRD2 در هر دو رده سلولی حساس و مقاوم بودند ، که MZ1 قوی تر از ARV-825 بود. توجه داشته باشید ، رده سلولی مقاوم در برابر JQ1 سطح پایه بالاتری از BRD4 را در مقایسه با همتای ساده خود نشان داد. این یافته مطابق با گزارش هایی است که نشان می دهد درمان با BETI بیان BRD4 را تنظیم نمی کند [18]. مهار کارآمد Brd4 و Brd2 به القای قابل توجهی از آپوپتوز در هر دو رده سلولی حساس و مقاوم ترجمه می شود. نکته قابل توجه ، این مکانیسم عمدتاً به کاسپازها بستگی دارد ، همانطور که با القاء کاسپاز 3 و مهار آپوپتوز مشاهده شده در درمان با یک مهار کننده کاسپاز نشان داده شده است. در یک روش مشابه ، پروتئین های BET باعث آسیب DNA می شوند ، همانطور که با فعال سازی H2AX اندازه گیری می شوند. با توجه به تأثیر این ترکیبات بر چرخه سلولی ، اگرچه BETI قادر به بازداشت در G1 بودند ، اما تأثیر پروتئین های Bet Pleiotropic تر بود و نشان دهنده افزایش اندکی در G2/M بود. افزایش بیان P21 و کاهش CDC25C دستگیری در ورود زودرس G2 برای سلولهای حساس و مقاوم ، نتایج مشاهده شده در سایر مطالعات بدخیمی خون شناسی را نشان می دهد [18].<0.05; **p <0.01; *** p <0.005. d . Expression levels of BRD4 and BRD2 in TNBC JQ1-resistant derived tumors. Tumor samples from C were collected, washed with cold PBS, minced, and homogenized in lysis buffer. Protein expression levels were analyzed by Weste blotting as described above. Calnexin was used as a loading control. Image J software was used for quantification

در مقایسه با عوامل مورد استفاده در محیط بالینی فعلی ، MZ1 یک فعالیت ضد پرولیفراتیو مربوطه را نشان داد ، و تنها Docetaxel اثربخشی بالاتری نشان داد. فعالیت بالای MZ1 احتمالاً دلیل عدم هم افزایی مشاهده شده هنگام ترکیب MZ1 با شیمی درمانی است. یک اثر قابل مقایسه با مهار کننده PARP تأیید شده Olaparib مشاهده شد. پروتئین های BET تعامل هم افزایی با مهار کننده های BCL-2 و CDK4/6 در لنفوم احتمالاً از طریق فعال سازی مسیرهای جبرانی نشان داده اند [16]. علاوه بر این ، داده ها حاکی از آن است که پروتئین ها می توانند مقاوم در برابر روشهای درمانی هدفمند فعلی مورد استفاده در برخی بدخیمی های خون شناختی باشند [16 ، 19].

سرانجام ، مطالعات حیوانی تأثیر MZ1 در تکثیر تومورهای مقاوم در برابر JQ1 را تأیید کرد. ما برای اولین بار تأیید کردیم که سلولهای مقاوم به JQ1 هنگام تزریق در موش های برهنه نیز مقاوم هستند. در مرحله بعد ، ما مشاهده کردیم که تجویز MZ1 باعث کاهش رشد این تومورها در داخل بدن می شود. ارزیابی تومورهای برداشته شده کاهش BRD4 در حیوانات تحت درمان با MZ1 را نشان داد ، تأیید کرد که این اثر ثانویه در کاهش این پروتئین است. در مقابل ، هیچ کاهش BRD2 بر خلاف یافته های مشاهده شده در رده های سلولی مشخص نشده است ، احتمالاً به دلیل اثر خفیف تر ترکیب بر این پروتئین.

نتیجه گیری

در این کار ما اثربخشی پروتئین ها در TNBC و سرطان تخمدان و در یک مدل TNBC مقاوم به Beti را شرح می دهیم. با توجه به این واقعیت که BETI در حال حاضر در TNBC در حال توسعه بالینی است و گزینه های درمانی موجود برای این بیماری محدود است ، یافته های ما شواهدی برای رشد بالینی این خانواده ترکیبات برای این نشانه ارائه می دهد.

در دسترس بودن داده ها و مواد

داده هایی که از یافته های این مطالعه پشتیبانی می کنند از نویسندگان مربوطه در صورت درخواست معقول در دسترس هستند.

نتیجه گیری